DNA sel bakteri merupakan molekul rantai ganda sirkuler yang merupakan kromosom bakteri. DNA sel bakteri dapat diisolasi dengan tiga tahap yaitu pertama, kita harus merusak dinding sel dari bakteri dan membran selnya untuk membantu ekstrasi dari komponen yang kita kehendaki. Kedua, harus bekerja pada kondisi yang baik hingga dapat menghambat atau menghacurkan turunan enzim yang dihasilkan dalam perusakan bakteri. Ketiga, harus menggunakan prosedur pemisahan yang menghasilkan makromolekul yang kita kehendaki.
Praktikum ini bertujuan untuk mengisolasi DNA bakteri. Pengislasian DNA ini dilakukan dengan dua cara yang berbeda yaitu dengan penambahan deterjen dan tanpa ditambah deterjen. Pada tabung yang ditambah dengan deterjen terbentuk benang halus ketika dilihat dengan mikroskop sedangkan yang tanpa deterjen tidak terbentuk. Hal ini disebabkan karena pada bakteri yang tidak ditambahkan dengan deterjen proses lisis membran selnya tidak terjadi dengan sempurna disamping itu juga, enzim yang dihasilkan bakteri selama proses lisis membran selnya tidak teratasi dengan baik tanpa deterjen.
1. Asam Deoksiribonukleat (DNA)
Asam deoksiribonukleat, lebih dikenal dengan DNA (bahasa Inggris: deoxyribonucleic acid), adalah sejenis asam nukleat yang tergolong biomolekul utama penyusun berat kering setiap organisme. Di dalam sel, DNA umumnya terletak di dalam inti sel.
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara ketiganya adalah: DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua.
Secara garis besar, peran DNA di dalam sebuah sel adalah sebagai materi genetik; artinya, DNA menyimpan cetak biru bagi segala aktivitas sel. Ini berlaku umum bagi setiap organisme. Di antara perkecualian yang menonjol adalah beberapa jenis virus (dan virus tidak termasuk organisme) seperti HIV (Human Immunodeficiency Virus).
Gambar 1. Struktur DNA
Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon. DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa.
Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki struktur cincin-ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika Guanin berikatan dengan Sitosin, maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika Adenin berikatan dengan Timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu komponen pembangun (building block) DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu gugus fosfat dan satu pasang basa yang disebut nukleotida. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan.
Rantai DNA memiliki lebar 22-24 Å, sementara panjang satu unit nukleotida 3,3 Å. Walaupun unit monomer ini sangatlah kecil, DNA dapat memiliki jutaan nukleotida yang terangkai seperti rantai. Misalnya, kromosom terbesar pada manusia terdiri atas 220 juta nukleotida.
Struktur untai komplementer DNA menunjukkan pasangan basa (adenin dengan timin dan guanin dengan sitosin) yang membentuk DNA beruntai ganda.Rangka utama untai DNA terdiri dari gugus fosfat dan gula yang berselang-seling. Gula pada DNA adalah gula pentosa (berkarbon lima), yaitu 2-deoksiribosa. Dua gugus gula terhubung dengan fosfat melalui ikatan fosfodiester antara atom karbon ketiga pada cincin satu gula dan atom karbon kelima pada gula lainnya. Salah satu perbedaan utama DNA dan RNA adalah gula penyusunnya; gula RNA adalah ribosa.
Gambar 2. Struktur untai komplementer DNA menunjukkan pasangan basa (adenin dengan timin dan guanin dengan sitosin) yang membentuk DNA beruntai ganda.
2. Bakteri
Bakteri, dari kata Latin bacterium (jamak, bacteria), adalah kelompok raksasa dari organisme hidup. Mereka sangatlah kecil (mikroskopik) dan kebanyakan uniselular (bersel tunggal), dengan struktur sel yang relatif sederhana tanpa nukleus/inti sel, sitoskeleton, dan organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Struktur sel mereka dijelaskan lebih lanjut dalam artikel mengenai prokariota, karena bakteri merupakan prokariota, untuk membedakan mereka dengan organisme yang memiliki sel lebih kompleks, disebut eukariota. Istilah "bakteri" telah diterapkan untuk semua prokariota atau untuk kelompok besar mereka, tergantung pada gagasan mengenai hubungan mereka.
Bakteri adalah yang paling berkelimpahan dari semua organisme. Mereka tersebar (berada di mana-mana) di tanah, air, dan sebagai simbiosis dari organisme lain. Banyak patogen merupakan bakteri. Kebanyakan dari mereka kecil, biasanya hanya berukuran 0,5-5 μm, meski ada jenis dapat menjangkau 0,3 mm dalam diameter (Thiomargarita). Mereka umumnya memiliki dinding sel, seperti sel hewan dan jamur, tetapi dengan komposisi sangat berbeda (peptidoglikan). Banyak yang bergerak menggunakan flagela, yang berbeda dalam strukturnya dari flagela kelompok lain.
Seperti prokariota (organisme yang tidak memiliki selaput inti) pada umumnya, semua bakteri memiliki struktur sel yang relatif sederhana. Struktur bakteri yang paling penting adalah dinding sel. Bakteri dapat digolongkan menjadi dua kelompok yaitu Gram positif dan Gram negatif didasarkan pada perbedaan struktur dinging sel. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang terdiri atas lapisan peptidoglikan yang tebal dan asam teichoic. Sementara bakteri Gram negatif memiliki lapisan luar, lipopolisakarida - terdiri atas membran dan lapisan peptidoglikan yang tipis terletak pada periplasma (di antara lapisan luar dan membran sitoplasmik).
Banyak bakteri memiliki struktur di luar sel lainnya seperti flagela dan fimbria yang digunakan untuk bergerak, melekat dan konjugasi. Beberapa bakteri juga memiliki kapsul atau lapisan lendir yang membantu pelekatan bakteri pada suatu permukaan dan biofilm formation. Bakteri juga memiliki kromosom, ribosom dan beberapa spesies lainnya memiliki granula makanan, vakuola gas dan magnetosom.
Beberapa bakteri mampu membentuk endospora yang membuat mereka mampu bertahan hidup pada lingkungan ekstrim.
3. Isolasi DNA
DNA dapat diisolasi, baik pada manusia maupun pada tumbuhan. DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Darah manusia terdiri atas plasma darah, globulus lemak, substansi kimia (karbohidrat, protein dan hormon), dan gas (oksigen, nitrogen dan karbon dioksida). Plasma darah terdiri atas eritrosit (sel darah merah), leukosit (sel darah putih) dan trombosit (platelet). Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih. Sel darah putih dijadikan pilihan karena memiliki nukleus, di mana terdapat DNA di dalamnya.
Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu: isolasi jaringan, dinding dan membran sel dilisiskan, diekstraksi dalam larutan, dipurifikasi, dan dipresipitasi. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm.
Ada 5 tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: isolasi jaringan, pelisisan dinding dan membran sel, pengekstraksian dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi. Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan, yaitu darah. Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan pelisis sel darah merah. Setelah dilakukan inkubasi, darah yang telah bercampur dengan pelisis sel darah merah tersebut lalu disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak nukleus sel darah putih. Tahap berikutnya adalah purifikasi. Tahap ini bertujuan untuk membersihkan sel darah putih dari zat-zat lainnya, dan tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan DNA menjadi terlihat.
Tahap isolasi jaringan; untuk mengisolasi jaringan sel darah putih, maka darah yang masih memiliki komponen-komponen lengkap perlu dipisahkan satu dengan lainnya sehingga yang tersisa hanya sel darah putih. Karena itu ke dalam tabung yang berisi darah diberikan larutan pelisis sel darah merah yang merupakan larutan hipotonis. Karena larutan tersebut hipotonis, maka akan terjadi hemolisis. Larutan pelisis sel darah merah terdiri atas EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid) yang akan membentuk kompleks (chelate) dengan ion logam, seperti Mg2+ yang merupakan kofaktor DNAse. Selanjutnya tabung dibolak-balik dengan gerakan memutar yang membentuk angka 8 agar larutan dapat menyatu dengan sempurna selama 10 menit. Darah yang telah bercampur dengan pelisis sel darah merah tersebut lalu disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang. Untuk melisiskan membran sel dan membran nukleus sel darah putih yang terisolasi tadi, diberikan larutan pelisis sel darah putih yang terdiri atas EDTA dan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) yang berfungsi untuk merusak lipid pada membran sel sehingga leukosit hancur.
Tahap selanjutnya yaitu purifikasi. Purifikasi bertujuan untuk membersihkan sel darah putih dari zat-zat lainnya; Ke dalam larutan tadi kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37°C. Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur. Tahap berikutnya yaitu presipitasi; Tahap presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan larutan presipitasi protein dan kemudian divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru yang memiliki kelarutan yang lebih rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Supernatan yang berisi DNA kemudian dituangkan ke dalam tabung berisi isopropanol dingin dan tabung dibolak-balik kembali dengan gerakan angka 8. Pemberian isopropanol bertujuan untuk visualisasi DNA. Selanjutnya tabung disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3000 rpm.
Hasil dari sentrifugasi adalah terdapatnya pelet DNA pada dasar tabung yang kemudian ditambahkan etanol 70% dan dibolak-balik kembali. Pemberian etanol bertujuan untuk membersihkan DNA dari pengotor-pengotornya. Setelah tercampur, tabung kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Hasil akhirnya adalah DNA yang berada pada tepi dasar tabung. Langkah akhirnya adalah dengan pemberian Tris-EDTA yang bertujuan untuk melarutkan kembali DNA untuk dipreservasi.
4. Isolasi DNA Bakeri
Untuk mengisolasi komponen makromolekular dari bakteri, kita harus melakukan tiga hal. Pertama, kita harus merusak dinding sel dari bakteri dan membrane selnya untuk membantu ekstrasi dari komponen yang kita kehendaki. Kedua, harus bekerja pada kondisi yang baik hingga dapat menghambat atau menghacurkan turunan enzim yang dihasilkan dalam perusakan bakteri. Ketiga, harus menggunakan prosedur pemisahan yang menghasilkan makromolekul yang kita kehendaki.
Prosedur kerja isolasi DNA bakteri berdasarkan eksperimen dari Makmur pada tahun 1961 adalah sebagai berikut.
Sel-sel bakteri dirusak dengan perlakuan awal dengan enzim putih telur, lisosim yang menghidrolisis dinding bakteri. Hasil dari melemahnya dinding sel bakteri adalah mudahnya memberikan kejutan osmotic. Akhirnya dinding sel bakteri akan mengalami lisis dalam lingkungan hipotonik.
Penambahan deterjen yang mengandung natrium dudocyl sulfat atau SDS akan melengkapi lisisnya bakteri dengan merusak residu membran bakteri. SDS juga menhambat aktivitas enzimatis yang berbahaya seperti nukleasis dibandingkan reaksi denaturasi dari deterjen.
Agen pengkhelat sitrat dan EDTA lebih jauh menghambat nukleolisis dengan mengembalikan ion logam divalen yang diperlukan untuk aktivitas inti. Metode eksperimen ini menggunakan beberapa macam metode pemisahan yang dapat memurnikan DNA yang terdapat pada sel bakteri. Secara khusus ion perklorat dapat memisahkan protein dari DNA. Kemudian kloroform isoamyl alkohol digunakan untuk denaturasi protein lebih jauh untuk sentrifugasi yang berbeda. Kemudian DNA akan diubah secara selektif selama penambahan etanol yang membuat menggulungnya serat panjang DNA dari makromolekul yang lain misalnya RNA dan protein yang terkoagulasi dalam bentuk nonserat. DNA kasar yang diperoleh, akhirnya dilarutkkan dan direpresipitasi dengan isopropanol di bawah kondisi yang hanya mendukung persipitasi DNA.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar
Mohon dukungan dan Komentarnya...