Kembali saya postingkan laporan praktikum biokimia. Data lengkap bisa di DOWNLOAD DISINI. Semoga bermanfaat.
Enzim adalah golongan protein yang paling banyak terdapat dalam sel hidup, dan mempunyai fungsi penting sebagai katalisator reaksi biokimia yang secara kolektif membentuk metabolisme perantara dari sel (Wirahadikusumah : 1989).
Enzim merupakan biokatalis yang dapat meningkatkan kecepatan reaksi dalam sistem biologi, dan enzim sendiri tidak mengalami perubahan selama reaksi. Tanpa adanya enzim, reaksi berlangsung sangat lambat dan sulit. Sedangkan dengan adanya enzim kecepatan reaksi dapat ditingkaykan sampai 107 kali lipat. Reaksi yang dikatalisis oleh enzim dapat bereaksi pada kondisi yang biasa (suhu dibawah 100oC, tekanan atmosfir dan pH netral) jika dibandingkan dengan reaksi kimia yang bersesuaian. (Redhana:2004)
Enzim sebagai katalisator jugamempunyai sifat-sifat seperti katalisator pada umumnya, seperti ikut bereaksi, tetapi pada akhir reaksi didapatkan kembali dalam bentuk semula. Hal tersebut mengakibatkan enzim dapat dipakai kembali setelah melaksanakan aktivitasnya. Enzim membantu reaksi dengan menyediakan jalur reaksi yang memiliki energi aktivasi yang lebih rendah untuk transisi substrat menjadi produk dibandingkan dengan produk yang tidak dikatalisis.
Dalam mengkatalisis suatu reaksi, aktivitas suatu enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya adalah assay enzim, kecepatan enzim, konsentrasi substrat, temperatur, koenzim dan gugus prostetik, isoenzim dan konsentrasi enzim.(Redhana:2004)
Aktivitas enzim dapat dipengaruhi oleh beberapa jenis molekul. Molekul-molekul yang menurunkan aktivitas katalitik enzim disebut inhibitor. Beberapa inhibitor enzim adalah metabolit seluler untuk mengendalikan jalur metabolit. Inhibitor lain mungkin berupa zat asing, seperti obat dan toksin, dimana pengaruhnya pada inhibisi enzim dapat berupa pengobatan dan pengaruh berbahaya yang dapat mematikan.Pada praktikum ini dilakukan percobaan untuk mengetahui pengaruh inhibitor terhadap aktivitas enzim dilihat dari harga Vmaks dan KM reaksi dengan inhibitor dan tanpa inhibitor.
Inhibitor merupakan suatu senyawa yang dapat menghambat atau menurunkan laju reaksi yang dikatalisis oleh enzim. Terdapat dua jenis inhibitor utama, yaitu inhibitor yang bekerja secara tidak balik (irreversible) dan inhibitor yang bekerja secara dapat balik (reversible).
Inhibitor tidak dapat balik bekerja dengan mengikat sisi aktif enzim melalui reaksi irreversible, E + I EI, sehingga inhibitor mengikat enzim, inhibitor tidak dapat dipisahkan dari sisi aktif enzim. Keadaan ini menyebabkan enzim tidak dapat mengikat substrat terhadap atau inhibitor merusak beberapa komponen (gugus fungsi) pada sisi katalitik molekul enzim.
Inhibitor dapat balik mengikat sisi aktif enzim melalui reaksi reversible dan inhibitor ini dapat dipisahkan atau dilepaskan kembali dari ikatannya, misalnya dengan dialisis. Inhibitor dapat balik terdiri dari dua jenis, yaitu inhibitor yang bekerja secara kompetitif, dan non-kompetitif .
Inhibitor Kompetitif
Inhibitor yang bekerja secara kompetitif umumnya mempunyai struktur tiga dimensi yang mirirp dengan substrat yang reaksinya dikatalisis oleh inhibitor tersebut. Oleh karena itu, dalam suatu campuran reaksi inhibitor akan bereaksi dengan substrat untuk terikat pada sisi aktif enzim. Enzim yang telah mengikat inhibitor tidak dapat bereaksi dengan substrat untuk menghasilkan produk, sedangkan enzim yang telah mengikat substrat dapat menghasilkan produk, tetapi tidak dapat berikatan dengan inhibitor.
Contoh inhibitor kompetitif adalah malonat yang menginhibisi reaksi yang dikatalisis oleh enzim suksinat dehidrogenase.
Enzim suksinat dehidrogenase mengkatalisis pembebasan dua atom hidrogen dari suksinat, yaitu satu dari masing-masing kedua gugus metilenya (-CH2-). Dehidrogenasi suksinat ini dihambat oleh malonat yang menyerupai suksinat karena sama-sama memiliki gugus karboksil bermuatan negatif yang berjarak tepat sehingga dapat menempati sisi aktif enzim. Akan tetapi, malonat tidak terhidrogenasi oleh enzim suksinat hidrogenase, malonat hanya menempati sisi aktif enzim tersebut dan menguncinya sehingga enzim tidak dapat bekerja pada substrat.
Inhibisi Non-Kompetitif
Inhibitor kompetitif mengikat enzim pada sisi pengikatan yang berbeda dari substrat. Dengan terikatnya inhibitor, aktivitas katalitik enzim menjadi rusak. Hal ini mungkin disebabkan oleh inhibitor terikat pada sisi katalitik enzim atau pada sisi yang lain (bukan sisi katalitik). Tetapi pengikatannya menyebabkan perubahan komformasi enzim yang mempengaruhi keadaan sisi katalitik walaupun tidak mempengaruhi sisi pengikatan substrat.
Inhibitor yang bekerja secara non-kompetitif dapat berikatan dengan molekul enzim bebas dan kompleks enzim-substrat menghasilkan kompleks inhibitor yang tidak aktif (tidak menghasilkan produk).
Kembali saya postingkan laporan praktikum biokimia. Data lengkap bisa di DOWNLOAD DISINI. Semoga bermanfaat.
Darah adalah cairan yang terdapat pada semua makhluk hidup (kecuali tumbuhan) tingkat tinggi yang berfungsi mengirimkan zat-zat dan oksigen yang dibutuhkan oleh jaringan tubuh, mengangkut bahan-bahan kimia hasil metabolisme, dan juga sebagai pertahanan tubuh terhadap virus atau bakteri.
Darah terdiri dari sel-sel darah (bagian padat darah) dan plasma darah (bagian cair darah). Sel-sel darah terdiri dari eritrosit (sel darah merah), leukosit (sel darah putih), trombosit (keping darah). Sedangkan plasma darah terdiri dari fibrinogen dan serum.
Serum darah adalah bagian dari plasma darah yang tidak mengandung fibrinogen. Di dalam serum darah terlarut protein, glukosa, mineral, hormon dan karbondioksida. Selain itu di dalam serum darah juga terdapat enzim transaminase.
Enzim transaminase adalah enzim yang mengkatalisis pemindahan gugus α-amino dari kebanyakan asam L-amino. Kebanyakan enzim transaminase bersifat spesifik bagi α-ketoglutarat sebagai molekul gugus amino. Namun, demikian, enzim tersebut tidak terlalu spesifik bagi substratnya, yaitu asam L-amino yang memberikan gugus aminonya.
Transaminasi adalah proses utama untuk mengeluarkan nitrogen dari asam amino. Umumnya nitrogen dipindahkan sebagai gugus amino dari asam amino asal ke α-ketoglutarat sehingga terbentuk glutamat, sementara asam amino semula berybah menjadi asam keto padanannya. (Girindra:2003)
Pada metabolisme asam amino, gugus α-amino dari ke-20 asam L-amino yang biasa dijumpai dalam protein dapat dipindahkan melalui reaksi degradasi oksidatif. Pemindahan gugus α-amino dari kebanyakan asam L-amino dikatalisis oleh enzim yang disebut transaminase atau aminotransferase. Pada reaksi ini gugus α-amino dipindahkan secara enzimatik ke atom karbon α pada α-ketoglutarat sehingga dihasilkan α-keto, analog dari asam amino yang bersangkutan. Reaksi ini menyebabkan aminasi α-ketoglutarat, membentuk L-glutamat. Reaksi yang terjadi, secara umum dapat dituliskan sebagai berikut:
Asam L-amino α-ketoglutarat asam α-keto glutamate (Redhana:2004
Kebanyakan enzim transaminase bersifat spesifik bagi a -ketoglutarat sebagai molekul penerima gugus amino. Glutamat dapat mengalami deaminasi oksidatif malalui reaksi yang dikatalisis oleh glutamat dehidrogenase yang menghasilkan ion amonium dan a-glutamat.
NADP+ berfungsi sebagai kofaktor, reaksi ini yang berlangsung di mitokondria sebagian besar sel bersifat reversibel. Reaksi ini dapat menggabungkan amonia ke glutamat atau membebaskan amonia dari glutamat. Akibat reaksi transaminase, glutamate, dapat diperoleh nitrogen dari asam amino lain dan melepaskan amonia melalui reaksi glutamat dehidrogenase. Proses ini merupakan salah satu sumber amonia yang masuk dalam siklus urea.
Namun, demikian, enzim tersebut tidak terlalu spesifik bagi substratnya, yaitu asam L-amino yang memberikan gugus aminonya. Berikut ini beberapa transaminase yang paling penting, dinamakan sesuai dengan molekul pemberi gugus aminonya.
Hati, ginjal, dan otot mengandung banyak transaminase glutamate-oksaloasetat (TGO), disebut juga sebagai aspartat aminotransferase dan transaminase glutamate piruvat (TGP), disebut sebagai alanin aminotransferase. Serum pada keadaan normal menunjukkan adanya aktivitas enzim tersebut, maka enzim-enzim intraseluler di atas akan keluar sel dan masuk ke dalam darah. Kenaikan aktivitas TGO dan TGP serum dapat dijumpai pada jenis penyakit yang menyangkut jaringan tertentu.
Kembali saya postingkan laporan praktikum biokimia. Data lengkap bisa di DOWNLOAD DISINI. Semoga bermanfaat.
Dalam kehidupan sehari-hari kita melakukan aktivitas. Untuk melakukan aktivitas itu, kita memerlukan energi yang dapat diperoleh dari bahan makanan yang kita makan. Pada umumnya bahan makanan itu mengandung tiga kelompok utama senyawa kimia, yaitu karbohidrat, lemak dan protein. Protein (akar kata protos dari bahasa Yunani yang berarti "yang paling utama") adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung karbon, hidrogen, oksigen, nitrogen dan kadang kala sulfur serta fosfor. Suatu molekul protein disusun oleh sejumlah asam amino tertentu dengan susunan yang sudah tertentu pula dan bersifat turunan. (Aisjah Girindra: 1986)
Protein merupakan biopolymer yang multifungsi, yaitu sebagai struktural pada sel maupun jaringan dan organ, sebagai enzim suatu biokatalis, sebagai pengemban atau pembawa senyawa atau zat ketika melalui biomembran sel, dan sebagai zat pengatur. Selain itu protein juga merupakan makromolekul yang paling berlimpah di dalam sel dan menyusun lebih dari setengah berat kering pada hampir semua organisme. Protein merupakan instrumen yang mengekspresikan informasi genetik. Protein mempunyai fungsi unik bagi tubuh, antara lain menyediakan bahan-bahan yang penting peranannya untuk pertumbuhan dan memelihara jaringan tubuh, mengatur kelangsungan proses di dalam tubuh, dan memberi tenaga jika keperluannya tidak dapat dipenuhi oleh karbohidrat dan lemak.
Untuk memenuhi kebutuhan protein dalam tubuh, seseorang harus mengkonsumsi makanan yang mengandung protein. Salah satu makanan yang mengandung protein yang sering dikonsumsi oleh manusia adalah telur. Telur biasanya dikonsumsi sebagai lauk. Untuk mengetahui kandungan protein dalam telur dapat dilakukan dengan berbagai cara, salah satunya adalah dengan metode Lowry. Kelebihan dari metode ini yaitu metode Lowry mempunyai sensitivitas tinggi yaitu 10-20 kali dari cara uv atau biuret. Disamping itu metode ini dapat mengukur kadar sampel yang sangat kecil, bahan yang diperlukan sedikit, serta waktu pengerjaan relatif singkat. Oleh karena itu, analisis kadar protein pada telur ini (larutan albumin) secara Lowry.
Reagen pendeteksi gugus-gugus fenolik, seperti reagen Folin-Ciaocalteu, dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi protein. Dalam bentuk paling sederhana reagen Folin-Ciaocalteu dapat mendeteksi residu tirosin (dalam protein) karena kandungan fenolik dalam residu tirosin yang mampu mereduksi reagen Folin-Ciaocalteu yang terdiri dari fosfotungstat dan fosfomolibdat menjadi tungstat dan molibdenum yang berwarna biru. Adapun reaksinya adalah sebagai berikut.
Reaksi reduksi fosfomolibdat oleh residu tirosin.
Reaksi reduksi fosfotungstat oleh residu tirosin
Tungstat dan molibdenum yang dihasilkan dalam reaksi ini menunjukkan puncak absorpsi yang lebarpada daerah merah dari spektrum sinar tampak pada panjang gelombang 600-800 nm.
Sensitifitas dari reagen Folin-Ciaocalteu ini mengalami perubahan yang cukup signifikan bila ditambahkan dengan reagen biuret ke dalam larutan protein. Hal ini disebabkan terbentuknya kompleks Cu-protein yang juga menyebabkan reduksi pada fosfotungstat dan fosfomolibdat. Dimana sekitar 75% dari reduksi yang terjadi akibat adanya kompleks Cu-protein. Dengan adanya penembahan reagen biuret maka sensitifitas warna yang dihasilkan akan meningkat sehingga pengukuran % transmitansi akan lebih meningkat.
Pengukuran % transmitansi dilakukan dengan menggunakan sfektrofotometer 20+. Dari hasil dari pengukuran % T ini kemudian dicari absorbansinya dengan menggunakan persamaan: A = - log T. Dari absorbansi yang didapatkan dapat dibuat kurva kalibrasi. Dari kurva kalibrasi ini dapat ditentukan konsentrasi protein.
Pada saat menentukan konsentrasi protein dalam sampel, harus dilakukan pula pengukuran terhadap beberapa larutan protein standar yang memiliki rentangan konsentrasi tertentu dimana konsentrasi sampel protein berada dalam rentangan tersebut. Protein dimasukkan pertama kali kedalam tabung reaksi, lalu ditambahkan aquades. Seluruh tabung harus mempunyai volume akhir yang sama. Reagen pembentuk kompleks selalu ditambahkan terakhir dan biasanya diperlukan selang waktu tertentu terjadinya reaksi yang sempurna. Larutan standar protein dan sampel diukur dengan spektrofotometri. Hasil pengukuran dibuat dalam kurva kalibrasi standar yang diperoleh dengan mengukur absorbansi sederetan larutan standar.
Kembali saya postingkan laporan praktikum biokimia. Data lengkap bisa di download disini. semoga bermanfaat.
Kromatografi merupakan suatu metode pemisahan yang didasarkan atas distribusi diferensial komponen sampel diantara dua fase. Salah satu fase dibuat diam dan dinamakan fase stasioner, fase diam dapat berupa padatan atau cairan yang terikat pada permukaan padatan. Fase yang lainnya dinamakan fase gerak yang bergerak diantara celah-celah atau permukaan fase stasioner, fase gerak dapat berupa cairan disebut eluen atau larutan. Gerakan fase gerak mengkibatkan terjadinya migrasi diferensial komponen-komponen dalam sampel. Pada proses kromatografi, berbagai komponen dipisahkan berdasarkan afinitas diferensial dari komponen-komponen tersebut.
Dalam proses komatografi, terjadinya pemisahan kmponen-komponen dalam sampel diakibatkan oleh beberapa kecenderungan. Adapun kecenderungan yang terjadi pada proses kromatografi adalah sebagai berikut.
1.Kecenderungan molekul-molekul komponen untuk melarut dalam cairan.
2.Kecenderungan molekul-molekul komponen untuk melekat pada permukaan padatan halus (adsorpsi).
3.Kecenderungan molekul-molekul untuk bereaksi secara kimia (penukar ion).
Kromatografi dapat digunakan dalam analisis kualitatif maupun kuantitatif. Keuntungan pemisahan dengan metode kromatografi dibandingkan dengan metode lainnya, antara lain jumlah sampel yang diperlukan relatif kecil (semimikro dan mikro), hasilnya lebih selektif dan akurat, serta waktu analisis singkat.
Kromatografi kertas merupakan salah satu metode pemisahan berdasarkan distribusi suatu senyawa pada dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Pemisahan sederhana suatu campuran senyawa dapat dilakukan dengan kromatografi kertas, prosesnya dikenal sebagai analisis kapiler dimana lembaran kertas berfungsi sebagai pengganti kolom.
Kromatografi kertas adalah salah satu pengembangan dari kromatografi partisii yang menggunakan kertas sebagai padatan pendukung fasa diam. Oleh karena itu disebut kromatografi kertas. Sebagai fasa diam adalah air yang teradsorpsi pada kertas dan sebagai larutan pengembang biasanya pelarut organik yang telah dijenuhkan dengan air.
Dalam kromatografi kertas fasa diam didukung oleh suatu zat padat berupa bubuk selulosa. Fasa diam merupakan zat cair yang polar, biasanya digunakan air (H2O) yang teradsorpsi dalam selulosa kertas. Fasa gerak berupa campuran pelaru yang nonpolar seperti n-butanol, fenol dan kolidin yang akan mendorong senyawa untuk bergerak disepanjang kolom kapiler. Analisis kualitatif menggunakan kromatografi kertas dilakukan dengan cara membandingkan harga relatif respon faktor (Rf). Nilai Rf identik dengan time retention (tR) atau volume retention (VR).
Harga Rf zat baku dapat diidentifikasikan komponen campuran, karena harga besaran ini bersifat khas untuk setiap zat asal digunakan jenis pengembang yang sama. Kadang-kadang pemisahan dalam satu arah belum memberikan hasil yang memuaskan. Untuk mendapatkan hasil yang lebih baik, dapat dipakai cara kromatografi kertas dua dimensi, yang mana letak kertas diubah sehingga arah pemisahan juga berubah.
Senyawa yang dianalisa dengan teknik kromatografi kertas dapat ditentukan lokasinya pada kertas dengan berbagai cara. Bila senyawa yang diuji menyerap sinar UV atau berflouresensi dengan sinar UV, noda atau spot dapatdideteksi dengan sinar UV ditempat gelap. Noda atau spot juga dapat ditentukan dengan menggunakan senyawa pewarna, misalnya dengan ninhidrin.
Pada percobaan ini dilakukan kromatografi kertas untuk mengidentifikasi jenis asam amino yang terdapat pada campuran asam amino. Hal ini dilakukan dengan membandingkan koefisien distribusi (Rf) dari campuran asam amino dengan Rf dari asam amino standar.
Kembali saya posting laporan praktikum. Untuk melihat file aslinya, silahkan Download disini
Enzim adalah golongan protein yang paling banyak terdapat dalam sel hidup, dan mempunyai fungsi penting sebagai katalisator reasksi biokimia yang secara kolektif membentuk metabolisme perantara dari sel. Enzim sebagai katalisator juga mempunyai sifat-sifat seperti katalisator pada umumnya, seperti ikut bereaksi, tetapi pada akhir reaksi didapatkan kembali dalam bentuk semula. Hal tersebut mengakibatkan enzim dapat dipakai kembali setelah melaksanakan aktivitasnya. Enzim membantu reaksi dengan menyediakan jalur reaksi yang memiliki energi aktivasi yang lebih rendah untuk transisi substrat menjadi produk dibandingkan dengan produk yang tidak dikatalisis.
Reaksi-reaksi kimia dalam tubuh secara tidak langsung dipengaruhi oleh enzim. Katalis-katalis ini, adalah spesifik untuk reaksi-reaksi tertentu. Akan tetapi, katalis-katalis ini sering berubah-ubah (tidak tetap), pada beberapa ribu enzim yang sekarang dikenal dapat berperan dalam beberapa reaksi seperti hidrolisis, polimerisasi, pemindahan gugus fungsi, oksidasi reduksi, dehidrasi dan isomerisasi, untuk menjelaskan hanya beberapa kelompok umum dari reaksi yang dipengaruhi enzim. Enzim-enzim bukanlah merupakan permukaan pasif pada mana reaksi berlangsung tetapi merupakan mesin molekul kompleks yang terus bekerja melalui rasikan mekanisme reaksi yang berbeda beda. Sebagai contoh, beberapa enzim hanya bekerja pada molekul-molekul substrat tunggal; lainnya bekerja pada dua atau lebih molekul-molekul substrat yang berbeda yang akan mengatur terjadi atau tidaknya suatu ikatan. Beberapa enzim membentuk ikatan kovalen yang menjadi perantara untuk membentuk kompleks dengan substrat-substratnya, tetapi ada juga yang tidak.
Kecepatan reaksi yang dikatalisis oleh enzim umumnya dinyatakan sebagai nilai pada waktu nol (Vo, dalam μmol/menit), karena kecepatan paling tinggi terjadi pada suatu keadaan dimana produk reaksi belum terbentuk. Pada keadaan ini konsentrasi substrat paling besar dan enzim belum dihambat secara umpan balik oleh produknya. Pada konsentrasi substrat tinggi, kecepatan reaksi enzimatik cenderung mempunyai nilai maksimum (Vmaks).
Pada praktikum ini, dilakukan percobaan untuk menentukan kecepatan reaksi maksimum (Vmaks) dan Km dari reaksi yang dikatalisis oleh enzim dengan mengunakan grafik hubungan antara laju reaksi enzimatis dengan konsentrasi substrat.
Laju reaksi awal (V0) dari reaksi yang dikatalisis oleh enzim meningkat dengan bertambahnya konsentrasi substrat hingga dicapai keadaan dimana penambahan substrat tidak lagi meningkatkan laju reaksi awal.
Gambar 01. Grafik hubungan konsentrasi substrat dan Vo plot langsung
Keadaan dimana laju reaksi awal maksimum (Vmaks) dicapai pada kondisi substrat jenuh diilustrasikan pada Gambar 01. Pada reaksi enzimatis atau hidrolisis substrat tunggal, dijelaskan postulat reaksi sebagai berikut:
Enzim (E) bergabung dengan substrat (S) membentuk kompleks enzim-substrat (ES). Kompleks ES dapat berdisosiasi lagi membentuk E dan S, atau dapat bereaksi membentuk E dan produk (P). Konstanta kecepatan k1, k2, k3 dan k4 menunjukkan kecepatan yang berhubungan dengan masing-masing tahap proses katalitik. Dari pengamatan terhadap beberapa enzim, diketahui bahwa kecepatan awal (V0) pada konsentrasi substrat rendah berbanding lurus dengan [S], sedangkan pada konsentrasi substrat tinggi, kecepatan cenderung mempunyai nilai maksimum, yaitu kecepatan yang tidak bergantung pada [S]. Kecepatan maksimum disebut Vmaks (μmol/menit). Michaelis dan Menten menurunkan persamaan untuk menjelaskan keadaan di atas:
Dari persamaan ini, Michaelis dan Menten mendefinisikan konstanta baru, KM, konstanta Michaelis (molar, M):
KM merupakan ukuran kestabilan kompleks ES, yaitu kecepatan penguraian kompleks ES sama dengan kecepatan pembentukan kompleks ES. Pada beberapa enzim, k2 lebih besar dari k3. pada kondisi ini, KM menjadi ukuran afinitas enzim terhadap substratnya karena nilai KM tergantung pada nilai relatif dari k1 dan k2, masing-masing untuk pembentukan an disosiasi kompleks ES. KM dapat ditentukan dengan cara eksperimen, dimana nilainya eqivalen dengan konsentrasi substrat pada saat kecepatan V0 sama dengan setengah dari Vmaks.
Karena Vmaks dapat dicapai pada konsentrasi substrat yang tidak tentu, sehingga tidak mungkin untuk menentukan harga Vmaks (demikian juga KM) dari grafik hiperbolik seperti yang ditunjukkan pada gambar 01. Akan tetapi, Vmaks dan KM dapat ditentukan secara eksperimen dengan mengukur V0 pada konsentrasi substrat yang berbeda. Kemudian dibuat pembalikan ganda atau plot Lineweaver-Burk dari 1/V0 terhadap 1/[S]. Plot ini merupakan turunan dari persamaan Michaelis-Menten:
Plot tersebut akan menghasilkan garis lurus, dengan titik potong pada sumbu 1/V0 adalah Vmaks dan titik potong pada sumbu 1/[S] adalah -1/KM. Kemiringan garis sama dengan KM/Vmaks.
Saya posting laporan praktikum biokimia. untuk mendapatkan file aslinya, silahkan download disini
DNA sel bakteri merupakan molekul rantai ganda sirkuler yang merupakan kromosom bakteri. DNA sel bakteri dapat diisolasi dengan tiga tahap yaitu pertama, kita harus merusak dinding sel dari bakteri dan membran selnya untuk membantu ekstrasi dari komponen yang kita kehendaki. Kedua, harus bekerja pada kondisi yang baik hingga dapat menghambat atau menghacurkan turunan enzim yang dihasilkan dalam perusakan bakteri. Ketiga, harus menggunakan prosedur pemisahan yang menghasilkan makromolekul yang kita kehendaki.
Praktikum ini bertujuan untuk mengisolasi DNA bakteri. Pengislasian DNA ini dilakukan dengan dua cara yang berbeda yaitu dengan penambahan deterjen dan tanpa ditambah deterjen. Pada tabung yang ditambah dengan deterjen terbentuk benang halus ketika dilihat dengan mikroskop sedangkan yang tanpa deterjen tidak terbentuk. Hal ini disebabkan karena pada bakteri yang tidak ditambahkan dengan deterjen proses lisis membran selnya tidak terjadi dengan sempurna disamping itu juga, enzim yang dihasilkan bakteri selama proses lisis membran selnya tidak teratasi dengan baik tanpa deterjen.
1.Asam Deoksiribonukleat (DNA)
Asam deoksiribonukleat, lebih dikenal dengan DNA (bahasa Inggris: deoxyribonucleic acid), adalah sejenis asam nukleat yang tergolong biomolekul utama penyusun berat kering setiap organisme. Di dalam sel, DNA umumnya terletak di dalam inti sel.
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara ketiganya adalah: DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua.
Secara garis besar, peran DNA di dalam sebuah sel adalah sebagai materi genetik; artinya, DNA menyimpan cetak biru bagi segala aktivitas sel. Ini berlaku umum bagi setiap organisme. Di antara perkecualian yang menonjol adalah beberapa jenis virus (dan virus tidak termasuk organisme) seperti HIV (Human Immunodeficiency Virus).
Gambar 1. Struktur DNA
Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon. DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa.
Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki struktur cincin-ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika Guanin berikatan dengan Sitosin, maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika Adenin berikatan dengan Timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu komponen pembangun (building block) DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu gugus fosfat dan satu pasang basa yang disebut nukleotida. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan.
Rantai DNA memiliki lebar 22-24 Å, sementara panjang satu unit nukleotida 3,3 Å. Walaupun unit monomer ini sangatlah kecil, DNA dapat memiliki jutaan nukleotida yang terangkai seperti rantai. Misalnya, kromosom terbesar pada manusia terdiri atas 220 juta nukleotida.
Struktur untai komplementer DNA menunjukkan pasangan basa (adenin dengan timin dan guanin dengan sitosin) yang membentuk DNA beruntai ganda.Rangka utama untai DNA terdiri dari gugus fosfat dan gula yang berselang-seling. Gula pada DNA adalah gula pentosa (berkarbon lima), yaitu 2-deoksiribosa. Dua gugus gula terhubung dengan fosfat melalui ikatan fosfodiester antara atom karbon ketiga pada cincin satu gula dan atom karbon kelima pada gula lainnya. Salah satu perbedaan utama DNA dan RNA adalah gula penyusunnya; gula RNA adalah ribosa.
Gambar 2. Struktur untai komplementer DNA menunjukkan pasangan basa (adenin dengan timin dan guanin dengan sitosin) yang membentuk DNA beruntai ganda.
DNA terdiri atas dua untai yang berpilin membentuk struktur heliks ganda. Pada struktur heliks ganda, orientasi rantai nukleotida pada satu untai berlawanan dengan orientasi nukleotida untai lainnya. Hal ini disebut sebagai antiparalel. Masing-masing untai terdiri dari rangka utama, sebagai struktur utama, dan basa nitrogen, yang berinteraksi dengan untai DNA satunya pada heliks. Kedua untai pada heliks ganda DNA disatukan oleh ikatan hidrogen antara basa-basa yang terdapat pada kedua untai tersebut. Empat basa yang ditemukan pada DNA adalah adenin (dilambangkan A), sitosin (C, dari cytosine), guanin (G), dan timin (T). Adenin berikatan hidrogen dengan timin, sedangkan guanin berikatan dengan sitosin.
2.Bakteri
Bakteri, dari kata Latin bacterium (jamak, bacteria), adalah kelompok raksasa dari organisme hidup. Mereka sangatlah kecil (mikroskopik) dan kebanyakan uniselular (bersel tunggal), dengan struktur sel yang relatif sederhana tanpa nukleus/inti sel, sitoskeleton, dan organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Struktur sel mereka dijelaskan lebih lanjut dalam artikel mengenai prokariota, karena bakteri merupakan prokariota, untuk membedakan mereka dengan organisme yang memiliki sel lebih kompleks, disebut eukariota. Istilah "bakteri" telah diterapkan untuk semua prokariota atau untuk kelompok besar mereka, tergantung pada gagasan mengenai hubungan mereka.
Bakteri adalah yang paling berkelimpahan dari semua organisme. Mereka tersebar (berada di mana-mana) di tanah, air, dan sebagai simbiosis dari organisme lain. Banyak patogen merupakan bakteri. Kebanyakan dari mereka kecil, biasanya hanya berukuran 0,5-5 μm, meski ada jenis dapat menjangkau 0,3 mm dalam diameter (Thiomargarita). Mereka umumnya memiliki dinding sel, seperti sel hewan dan jamur, tetapi dengan komposisi sangat berbeda (peptidoglikan). Banyak yang bergerak menggunakan flagela, yang berbeda dalam strukturnya dari flagela kelompok lain.
Seperti prokariota (organisme yang tidak memiliki selaput inti) pada umumnya, semua bakteri memiliki struktur sel yang relatif sederhana. Struktur bakteri yang paling penting adalah dinding sel. Bakteri dapat digolongkan menjadi dua kelompok yaitu Gram positif dan Gram negatif didasarkan pada perbedaan struktur dinging sel. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang terdiri atas lapisan peptidoglikan yang tebal dan asam teichoic. Sementara bakteri Gram negatif memiliki lapisan luar, lipopolisakarida - terdiri atas membran dan lapisan peptidoglikan yang tipis terletak pada periplasma (di antara lapisan luar dan membran sitoplasmik).
Banyak bakteri memiliki struktur di luar sel lainnya seperti flagela dan fimbria yang digunakan untuk bergerak, melekat dan konjugasi. Beberapa bakteri juga memiliki kapsul atau lapisan lendir yang membantu pelekatan bakteri pada suatu permukaan dan biofilm formation. Bakteri juga memiliki kromosom, ribosom dan beberapa spesies lainnya memiliki granula makanan, vakuola gas dan magnetosom.
Beberapa bakteri mampu membentuk endospora yang membuat mereka mampu bertahan hidup pada lingkungan ekstrim.
3.Isolasi DNA
DNA dapat diisolasi, baik pada manusia maupun pada tumbuhan. DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Darah manusia terdiri atas plasma darah, globulus lemak, substansi kimia (karbohidrat, protein dan hormon), dan gas (oksigen, nitrogen dan karbon dioksida). Plasma darah terdiri atas eritrosit (sel darah merah), leukosit (sel darah putih) dan trombosit (platelet). Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih. Sel darah putih dijadikan pilihan karena memiliki nukleus, di mana terdapat DNA di dalamnya.
Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu: isolasi jaringan, dinding dan membran sel dilisiskan, diekstraksi dalam larutan, dipurifikasi, dan dipresipitasi. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm.
Ada 5 tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: isolasi jaringan, pelisisan dinding dan membran sel, pengekstraksian dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi. Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan, yaitu darah. Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan pelisis sel darah merah. Setelah dilakukan inkubasi, darah yang telah bercampur dengan pelisis sel darah merah tersebut lalu disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak nukleus sel darah putih. Tahap berikutnya adalah purifikasi. Tahap ini bertujuan untuk membersihkan sel darah putih dari zat-zat lainnya, dan tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan DNA menjadi terlihat.
Tahap isolasi jaringan; untuk mengisolasi jaringan sel darah putih, maka darah yang masih memiliki komponen-komponen lengkap perlu dipisahkan satu dengan lainnya sehingga yang tersisa hanya sel darah putih. Karena itu ke dalam tabung yang berisi darah diberikan larutan pelisis sel darah merah yang merupakan larutan hipotonis. Karena larutan tersebut hipotonis, maka akan terjadi hemolisis. Larutan pelisis sel darah merah terdiri atas EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid) yang akan membentuk kompleks (chelate) dengan ion logam, seperti Mg2+ yang merupakan kofaktor DNAse. Selanjutnya tabung dibolak-balik dengan gerakan memutar yang membentuk angka 8 agar larutan dapat menyatu dengan sempurna selama 10 menit. Darah yang telah bercampur dengan pelisis sel darah merah tersebut lalu disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang. Untuk melisiskan membran sel dan membran nukleus sel darah putih yang terisolasi tadi, diberikan larutan pelisis sel darah putih yang terdiri atas EDTA dan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) yang berfungsi untuk merusak lipid pada membran sel sehingga leukosit hancur.
Tahap selanjutnya yaitu purifikasi. Purifikasi bertujuan untuk membersihkan sel darah putih dari zat-zat lainnya; Ke dalam larutan tadi kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37°C. Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur. Tahap berikutnya yaitu presipitasi; Tahap presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan larutan presipitasi protein dan kemudian divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru yang memiliki kelarutan yang lebih rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Supernatan yang berisi DNA kemudian dituangkan ke dalam tabung berisi isopropanol dingin dan tabung dibolak-balik kembali dengan gerakan angka 8. Pemberian isopropanol bertujuan untuk visualisasi DNA. Selanjutnya tabung disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3000 rpm.
Hasil dari sentrifugasi adalah terdapatnya pelet DNA pada dasar tabung yang kemudian ditambahkan etanol 70% dan dibolak-balik kembali. Pemberian etanol bertujuan untuk membersihkan DNA dari pengotor-pengotornya. Setelah tercampur, tabung kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Hasil akhirnya adalah DNA yang berada pada tepi dasar tabung. Langkah akhirnya adalah dengan pemberian Tris-EDTA yang bertujuan untuk melarutkan kembali DNA untuk dipreservasi.
4.Isolasi DNA Bakeri
Untuk mengisolasi komponen makromolekular dari bakteri, kita harus melakukan tiga hal. Pertama, kita harus merusak dinding sel dari bakteri dan membrane selnya untuk membantu ekstrasi dari komponen yang kita kehendaki. Kedua, harus bekerja pada kondisi yang baik hingga dapat menghambat atau menghacurkan turunan enzim yang dihasilkan dalam perusakan bakteri. Ketiga, harus menggunakan prosedur pemisahan yang menghasilkan makromolekul yang kita kehendaki.
Prosedur kerja isolasi DNA bakteri berdasarkan eksperimen dari Makmur pada tahun 1961 adalah sebagai berikut.
Sel-sel bakteri dirusak dengan perlakuan awal dengan enzim putih telur, lisosim yang menghidrolisis dinding bakteri. Hasil dari melemahnya dinding sel bakteri adalah mudahnya memberikan kejutan osmotic. Akhirnya dinding sel bakteri akan mengalami lisis dalam lingkungan hipotonik.
Penambahan deterjen yang mengandung natrium dudocyl sulfat atau SDS akan melengkapi lisisnya bakteri dengan merusak residu membran bakteri. SDS juga menhambat aktivitas enzimatis yang berbahaya seperti nukleasis dibandingkan reaksi denaturasi dari deterjen.
Agen pengkhelat sitrat dan EDTA lebih jauh menghambat nukleolisis dengan mengembalikan ion logam divalen yang diperlukan untuk aktivitas inti. Metode eksperimen ini menggunakan beberapa macam metode pemisahan yang dapat memurnikan DNA yang terdapat pada sel bakteri. Secara khusus ion perklorat dapat memisahkan protein dari DNA. Kemudian kloroform isoamyl alkohol digunakan untuk denaturasi protein lebih jauh untuk sentrifugasi yang berbeda. Kemudian DNA akan diubah secara selektif selama penambahan etanol yang membuat menggulungnya serat panjang DNA dari makromolekul yang lain misalnya RNA dan protein yang terkoagulasi dalam bentuk nonserat. DNA kasar yang diperoleh, akhirnya dilarutkkan dan direpresipitasi dengan isopropanol di bawah kondisi yang hanya mendukung persipitasi DNA.
Mohon maaf lama udah ga posting, ini saya sampaikan posting untuk materi kuliah biokimia. banyak gambar dan rumus yang tidak bisa masuk. untuk itu, silahkan download disini agar mendapat file yang lebih lengkap.
Senyawa-senyawa asilgliserol merupakan jumlah lipid terbesar di dalam tubuh. Triasilgliserol adalah senyawa lipid yang penting di dalam timbunan lemak (gajih) dan dalam makanan. Selain itu, senyawa asilgliserol, khususnya fosfolipid, menjadi komponen penting membran plasma dan membran lainnya. Fosfolipid juga mengambil bagian dalam proses metabolisme banyak senyawa lipid. Glikospingolipid yang mengandung sfingosin dan residu gula, disamping asam-asam lemak, membentuk 5-10% dari senyawa lipid pada membran plasma.
1. Biosintesis Asilgliserol
Reaksi yang meliputi hidrolisis triasilgliserol oleh lipase dapat dibalik di dalam laboratorium. Namun pembalikan reaksi bukan mekanisme untuk sintesis senyawa-senyawa asilgliserol di dalam jaringan. Sebelum disatukan ke dalam asilgliserol, baik gliserol dan asam lemak diaktifkan terlebih dahulu oleh ATP. Enzim gliserol kinase akan mengkatalisis proses aktivasi gliserol menjadi sn-gliserol-3-fosfat. Jika enzim ini tidak ada atau dengan aktivitas rendah seperti dalam jaringan otot atai adiposa sebagian besar gliserol-3-fosfat harus berasal dari zat antara pada sistem glikolisis, yaitu dihidroksiaseton fosfat, yang membentuk gliserol-3-fosfat melalui reduksi dengan NADH, yang dikatalisis oleh gliserol-3-fosfat dehidrogenase.
Biosintesis Triasilgliserol
Asam lemak diaktifkan menjadi asil-KoA oleh enzim asil-KoA sintetase, dengan menggunakan ATP dan KoA. Dua molekul asil KoA bergabung dengan gliserol-3-fosfat untuk membantuk senyawa fosfatidat (1,2-diasilgliserol fosfat). Proses ini berlangsung dalam dua tahap lewat lisofosfatidat, yang mula-mula dikatalisis oleh gliserol-3-fosfat asiltransferase dan kemudian oleh 1-asil gliserol-3-fosfat asiltransferase (lisofosfatidat asiltransferase). Senyawa fosfatidat diubah oleh enzim fosfatidat fosfohidrolase menjadi 1,2-diasilgliserol. Dalam mukosa usus terdapat lintasan monoasilgliserol, dan lewat lintasan ini monoasilgliserol diubah menjadi 1,2-diasilgliserol sebagai akibat dari adanya enzim monoasilgliserol asiltransferase. Molekul asil KoA berikutnya akan mengalami esterifikasi dengan diasilgliserol hingga terbentuk triasilgliserol yang dikatalisis oleh diasdilgliserol transferase. Sebagian aktivitas enzim ini berada dalam retikulum endoplasma sel, tapi sebagian lagi berada dalam mitokondria. Aktivitas fosfotidat fosfohidrase terutama ditemukan dalam fraksi supernatan bebas-partikel tetapi juga terikat dengan membran plasma.
Biosintesis Fosfogliserol
Senyawa-senyawa fosfolipid dapat disintesis dari fosfatidat, misalnya fosfatidilinositol, atau dari 1,2-diasil gliserol, misalnya fosfatidilkolin dan fosfatidiletanolamin. Dalam sintesis fosfattidilinositol, senyawa sitidin trifosfat (CTP), yaitu senyawa fosfat berenergi tinggi dari ATP bereaksi dengan fosfatidat untuk membentuk sitidin-difosfat-diasilgliserol (CDP-diasilgliserol). Akhirnya senyawa ini bereaksi dengan inisitol, dengan dikatalisis oleh enzim CDP-diasilgliserol inositol transferase, untuk membentuk fosfatidilinositol. Melalui fosforilasi berurutan, fosfotidilinositol mula-mula ditransformasikan menjadi fosfatidilinositol 4-fosfat dan kemudian menjadi fosfatidilinositol-4,5-bifosfat. Senyawa terakhir ini dipecah menjadi diasilgliserol dan inositol trifosfat oleh hormon-hormon yang meningkatkan Ca2+. Kedua produk ini bertindak sebagai pengantar kedua dalam kerja hormon tersebut.
Dalam biosintesis fosfatidilkolin dan fosfatdiletanolamin pertama-tama harus diubah menjadi kolin aktif atau etanolamin aktif. Proses perubahan ini merupakan proses dua tahap yang meliputi reaksi dengan ATP untuk membentuk sitidin difosfokolin (CDP-kolin) atau sitidin difosfoetanolamin (CDP-etanolamin). Dalam bentuk ini, kolin atau etanolamin bereaksi dengan 1,2-diasilgliserol sehingga basa terfosforilasi (fosfokolin dan fosfoatanolamin) akan dialihkan kepada diasilgliserol untuk membentuk masing-masing fosfatidikolin atau fosfatidietanolamin.
Senyawa asilgliserol plasmelogenetik merupakn salah satu senyawa pada posisi 1 (atau 2) mempunyai residu alkenil, yang mengandung ikatan vinil eter aldehidrogenik (-CH2-O-CH=CH-R’). Dihidroksi asetin fosfat merupakan prazat moeitas gliserol. Senyawa ini bergabung dengan asil Koa menjadi 1-asilhidroksiketon fosfat. Raksi pertukaran berlangsung diantara gugus asil dan akohol rantai panjang, sehingga 1-alkilhidroksiketon fosfat (yang mengandung ikatan eter) diubah menjadi 1-alkilglisrol-3-fosfat, dengan adanya NADPH. Setelah asilasi, selanjutnya pada posisi 2, senyawa 1-alkil-2-asilgliserol-3-fosfat yang dihasilkan dihidrolisis menjadi derivat glisrol bebas. Senyawa plasmalogen dibentuk dari desaturasi derivat analog 3-fosfoetanolamin dalam mitokondria terdiri atas senyawa plasmalogen. Faktor pengaktif-trombosit disintesis dari derivat 3-fosfokolin yang bersesuaian dan dikenal sebagai senyawa 1-alkil-2-asetil-sn-gliserol-3-fosfokolin.
2. Biosintesis Sfingolipid
Senyawa asam amino-sfingosin disintesis di dalam retikulum endoplasma. Dengan mengikuti proses aktivasi melalui perhubungan dengan piridokasalfosfat, asam amino serin bergabung dengan palmitoil-KoA untuk membentuk 3-ketosfinganin sesudah hilangnya CO2. Sfingosin sendiri dibentuk setelah tahap reduksi, yang diketahui menggunakan NADPH sebagai donor H. Tahap ini kemudian diikuti oleh tahap oksidasi yang melibatkan enzim plavoprotein; tahap oksidasi ini analog dengan tahap asil KoA dehidrogenase dalam oksidasi-β.
Seramida (N-asilsfingosin) dibentuk melalui penggabungan asil-KoA dan spingosin. Gugus asil sering diwakili oleh asam monoenoat atau asam lemak jenuh rantai panjang.
Spingomielin merupakan fosfolipid dan dibentuk kalau seramida bereaksi dengan CDP-kolin atau dengan fosfattidilkolin; reaksi yang disebutkan pertama analog dengan reaksi yang dipakai dalam biosintesis fosfatidilkolin.
Secara khas, asam lemak C24 terdapat dalam banyak senyawa glikospingolipid, khususnya senyawa glikospingolipid di dalam otak (asam lignoserat, serebronat dan nervonat). Asam lignoserat (C23H47COOH) disintasis sepenuhnya dari asetil KoA. Asam serebronat yaitu derivat 2-hidroksi asam lignoserat, dibentuk darinya. Asam nervonat (C23H45COOH), suatu asam tak jenuh tunggal, terbentuk melalui perpanjangan asam oleat.
Senyawa glikosfingolipid yang paling sederhana (serebrosida) adalah galaktosilseramida (GalCer) dan glukoseramida (GlcCer). Galcer merupakan senyawa lipid yang penting pada mielin, sedangkan glcCer adalah glikosfingilipid yang penting pada jaringan ekstraneural serta menjadi prazat sebagian besar senyawa glikosfingiolipd yang lebih kompleks.
Uridin difosfogalaktosa epimerase menggunakan uridin difosfat glukosa (UDPGlc) sebagai substrat dan melaksanakan epimerasi moeitas glukosa menjadi galaktosa, dan dengan demikian membentuk uridin difosfat galaktosa (UDPGal). Galaktosilseramida dibentuk dalam suatu reaksi antara seramida dan UDPGal. Sulfogalaktosilseramida dibentuk sesudah reaksi selanjutnya dengan 3’-fosfoadenosin-5’-fosfosulat (PAPS;”sulfat aktif”). PAPS juga terlibat dalam biosintesis senyawa sulfo(galakto)gliserolipid dan steroid sulfat.
Gangliosida disintesis dari seramida melalui penambahan bertahap senyawa-senyawa gula aktif dan asam sialat yaitu biasanya asam N-astilneuraminat. Gangliosida dengan berat molekul yang semakin tinggi bisa dibentuk dalam jumlah yang besar. Sebagian besar enzim yang mengalihkan gula dari senyawa nukleotida gula (glikosil transferase) ditemukan dalam aparatus golgi.
Glikosfingolipid merupakan unsur pembentuk lipatan luar membran plasma, dan sebagian unsur pembentuk tersebut, senyawa ini mungkin mempunyai peranan pentig dalam komunikasi serta kontak antar sel, sebagian senyawa glikosfingolipid merupakan antigen . Rantai oligosakarida yang serupa dijumpai dalam senyawa glikoproteindi dalam membran plasma. Jenis-jenis gangliosida tertentu berfungsi sebagai reseptor untuk toksin bakteri.
PENGANGKUTAN DAN PENYIMPANAN LIPID
Pengangkutan Lipid
Lemak yang diserap dalam makanan dan lipid yang disintesis oleh hati serta jaringan adiposa harus diangkut di antara berbagai jaringan dan organ tubuh untuk digunakan serta disimpan. Karena lipid tidak larut dalam air, timbul permasalahan bagaimana pengangkutannya dalam plasma darah. Permasalahan tersebut dipecahkan melalui pengikatan senyawa-senyawa lipid non polar (triasilgliserol dan ester kolestril) dengan lipid ampifatik(posfolipid dan kolesterol) serta protein untuk membentuk lipoprotein yang bisa bercampur dengan air
Ekstraksi senyawa lipid plasma dengan pelarut lipid yang sesuai, dan pemisahan hasil ekstraksi selanjutnya menjadi berbagai kelompok lipid memperlihatkan adanya trigliserol, posfolipid, kolesterol dan ester kolesteril. Disamping itu terlihat pula adanya fraksi asam lemak rantai panjang tak teresterifikasi(asam lamak bebas) dalam jumlah yang jauh lebih sedikit dan membentuk kurang dari 5% total asam lemak yang ada di dalam plasma darah. Asam lemak bebas kini dikenal sebagai lipid plasma yang secara metabolik paling aktif.
Lemak murni mempunyai densitas lebih rendah daripada densitas air. Oleh karena itu, semakin tinggi proporsi lipid terhadap protein dalam lipoprotein, semakin rendah densitasnya (tabel 01). Sifat ini dipakai untuk memisahkan berbagai lipoprotein dalam plasma darah dengan ultra sentrifugasi. Komposisi berbagai fraksi lipoprotein yang berlainan ini dan diperoleh melalui sentrifugasi diperlihatkan pula dalam tabel 01
Selain penggunaan berbagai teknik yang bergantung pada densitasnya, lipoprotein dapat pula dapat pula dipisahkan menurut sifat-sifat elektroforesisnya menjadi lipoprotein α, -β, pre-β dan dapat diidentifikasi lebih akurat dengan cara-cara imuno elektroforesis.
Diluar FFA sudah dikenali 4 kelompok penting lipoprotein yang mempunyai makna penting secara fisiologis dan dalam diagnosis klinik. Keempat kelompk ini adalah:
ØKilomikron yang berasal dari penyerapan triasilgliserol dalam usus.
ØVery Low density lipoprotein (VLDL atau pre-β-lipoprotein) yang berasal dari hati untuk mengeluarkan triasilgliserol
ØLow density lipoprotein (LDL) yang memperlihatkan tahap akhir dalam katabolisme VLDL.
ØHigh density lipoprotein (HDL atau α -lipoprotein) yang terlibat dalam metabolisme VLDL, kimikron dan juga kolesterol.
Triasil gliserol merupakan unsur lipid yang dominan di dalam kimikron dan VLDL, sedangkan kolesterol dan fosfolipid masing-masing dominan dalam LDL dan HDL.
Pengangkutan Triasilgliserol
Berdasarkan definisinya, kilomikron ditemukan dalam cairan getah bening (chyle) yang dibentuk hanya oleh sistem limfatik yang mengaliri usus halus. Kilimikron ini bertanggung jawab atas pengangkutan semua lipid dari makanan di dalam sirkulasi darah. Pembentukan kilomikron meningkat bersamaan dengan semakin besarnya jumlah triasilgliserol yang diserap.
Sebagian VLDL plasma berasal dari hati. VLDL merupakan alat pengangkut triasilgliserol dari hati ke jaringan ekstrahepatik. Antara mekanisme pembentukan kilomikron oleh sel-sel usus dan pembentukan VLDL oleh sel-sel parenkim hati terdapat banyak persamaan. Apoliprotein B (Apoliprotein utama LDL atau -β-lipoprotein) disintesis oleh ribosom dalam retikulum endoplasmik kasar dan disatukan dengan lipoprotein dalam retikulum endoplasmik halus merupakan tempat utama triasil gliserol. Lopoprotein mengalir lewat aparatus dan dalam organ sel ini diperkirakan terjadi penambahan residu karbohidrat pada lipoprotein. Kilomikron dan VLDL dilepas dari sel usus atau sel hati melalui penyatuan vakuola sekresi dengan membran sel (pinositosis kebalikan). Kilomikron mengalir dalam ruang antar sel usus dan akhirnya berjalan ke dalam sistem limfatik (lakteal), yang mengosongkam isisnya ke dalam intestinum. VLDL disekresikan oleh sel parenkim hati ke dalam ruang Disse dan kemudian ke dalam sinusoid hepatika lewat fenestra dala lapisan endotel. Kesamaan antara dua proses tersebut dan mekanisme anatominya sangat mencolok, karena – di luar kelenjar mammai – usus dan hati merupakan satu-satunya jaringan yang mengekresikan lipid tertentu. Ketidakmampuan lipid tertentu yang berukuran kilomikron dan VLDL tersebut untuk melintasi sel-sel endotel pembuluh kapiler tanpa proses hidrolisis sebelumnya, mungkin menjadi alasan bagi lemak makanan memasuki sirkulasi darah lewat sistem limfatik (duptus toraksikus) dan bukan lewat forta hati.
Walaupun demikian, baik kilomikron maupun VLDL yang terisolasi dari darah sama-sama mengandung apolipoprotein C dan E, lipoprotein “nascent” atau lipoprotein yang baru disekresikan hanya mengandung sedikit atau tidak mengandung sama sekali apolipoprotein tersebut, dan komplemen lengkap polipeptida apo C serta E terlihat diekstrasi melalui pengalihan dari HDL begitu kilomikron dan VLDL memasuki sirkulasi darah.
Triasilgliserol pada Kilomikron dan VLDL Dihidrolisis oleh Lipoprotein Lipase
Antara kemampuan jaringan untuk menyatukan asam-asam lemak triasilgliserol lipoprotein dan aktivitas enzim lipoprotein lipase, terdapat korelasi yang bermakna. Enzim ini berada pada dinding pembuluh darah kapiler yang terikat rantai proteoglikan pada heparan sulfat, dan ditemukan dalam jaringan adiposa, jantung, paru, medula renalis, aorta, diafragma serta glandula mammai dalam keadaan laktasi. Darah normal tidak mengandung enzim tersebut dalam jumlah berarti, namun setelah penyuntikan heparin lipoprotein lipase akan dilepas dari heparan sulfat yang mengikatnya, lalu masuk ke dalam darah dengan disertai penjernihan lipemia. Lipase juga dilepaskan dari hati oleh sejumlah besar heparin, tetapi enzim ini memperhatikan sifat-sifat yang berbeda dengan sifat-sifat lipoprotein lipase dan tidak mudah bereaksi dengan kilomikron.
Baik fosfolipid maupun apolipoprotein C-II (polopeptida berukuran lebih kecil yang dapat dialihkan secara bebas diantara beberapa lipoprotein yang berlainan) diperlukan sebagai kofaktor untuk aktivitas lipoprotein lipase. Apo C-II mempunyai tempat pengikatan fosfolipid spesifik yang lewat tempat pengikatan ini melekat pada protein. Jadi, kilomikron dan VLDL menghasilkan enzim untuk proses metabolismenya sendiri bersama dengan substrat dan kofaktornya. Hidrolisis berlansung sementara lipoprotein terikata dengan enzim tersebut pada endotelium.
Triasilgliserol dihidrolisis terus lewat diasilgliserol menjadi monoasilgliserol yang kemudian dihidrolisis menjadi asam lemak bebas dan gliserol. Sebagian asam lemak bebas yang dilepaskan ini akan kembali ke dalam sirkulasi darah dan melekat pada albumin, namun jumlah terbesarnya akan diangkut ke dalam jaringan (gambar 07).
Reaksi dengan lipoprotein lipase mengakibatkan hilangnya 90% triasilgliserol pada kilomikron dan hilangnya apo C (yang kembali pada HDL) tetapi bukan APO E. Lipoprotein yang dihasilkan atau sisa kilomikron menjadi lebih kaya dengan kolesterol dan ester kolesteril dengan hilangnya triasilgliserol. Perubahan yang sama terjadi pada VLDL, dengan pembentukan sisa-sisa VLDL atau IDL (intermediate-density lipoprotein). Sisa-sisa kilomikron diambil oleh hati sedangkan senyawa ester kolesteril dan triasilgliserol akan dihidrolisis serta dimetabolasi.
Metabolasi LDL
Sebagian besar LDL terbentuk dari VLDL, dan sebagian produksi LDL dilaksanakan oleh hati. HDL disintesis disekresikan baik dari hati maupun intestinum (gambar 07). Namun demikian HDL nascent (baru disekresikan) hanya mengandung apolipoprotein A (α-lipoprotein). Funsi utama HDL adalah sebagai tempat penyimpanan untuk apolipoprotein A dan C yang dibutuhkan dalam metabolisme kilomikron dan VLDL.
HDL nascent terdiri atas lapisan ganda fosfolipid berbentuk cakram yang mengandung hapolipoprotein dan kolesterol bebas. Lipoprotein ini serupa dengan partikel yang ditemukan dalam plasma penderita defisiensi enzim lesitin: kolesterol asiltransferase (LCAT) dan dalam plasma penderita ikterusobstruktif. LCAT dan aktivator LCAT apolipoprotein A-I- terikat dengan cakram tersebut. Proses katalisis oleh LCAT mengubah fosfolipid permukaan dan kolesterol bebas menjadi ester kolesteril dan lisolesitin. Ester kolestril nonpolar bergerak ke bagian enterior yang bersifat hidrofobik, sementara lisolesitin dialihkan pada albuminplasma. Reaksi tersbut berlanjut dengan menghasilkan inti nonpolar yang mengupayakan pemisahan lapisan ganda menjadi HDL sferis pseudomisel, yang disalut oleh selaput permukan senyawa lipid polar dan apolipoprotein.
Kolesterol yang tereksterifikasi dapat dialihkan dari HDL kepada lipoprotein yang intensitasnya lebih rendah seperti kilomikron, VLDL dan LDL, dengan bantuan protein pengalih ester kolesterol (Apo D) yang merupakan unsur lain pembentuk HDL. Jadi, protei pengalih ester kolesteril memungkinkan pengangkutan ester kolesteril pada HDL ke hati lewat sisa-sisa kilomikron serta VLDL atau lewat pengambilan LDL dalam hati.
Peranan hati dalam pengangkutan dan metabolisme lipid
Hati melaksanakan sejumlah fungsi utama dalam metabolisme lipid, yang diantaranya:
ØHati memudahkan pencernaan dan penyerapan lipid melalui getah empedu yang mengandung kolesterol serta garam-garam empedu yang disintesis dalam hati.
ØHati mempunyai sejumlah sistem enzim yang aktif untuk sintesis serta oksidasi asam-asam lemak dan untuk sintesis triasilgliserol, fosfolipid serta kolesterol.
ØHati mensintesis lipoprotein plasma.
ØHati mengubah asam-asam lemak menjadi badan keton (ketogenesis)
ØHati berperan dalam metabolisme lipoprotein plasma.
Sekresi VLDL Hepatik
Senyawa-senyawa triasilgliserol hepatik merupakan prazat triasilgliserol yang terkandung di dalam VLDL plasma. Sintesis trasil gliserol menghasilkan rangsangan segera untuk pembentukan dan sekresi VLDL. Asam-asam lemak yang digunakan dalam sintesis senyawa triasilgliserol hepatik berasal dari:
1.sintesis di dalam hati dari asetil-KoA yang terutama berasal dari karbohidrat,
2.asam lemak bebas dari dalam darah.
Faktor-faktor yang mendorong sintesis triasilgliserol dan sekresi VLDL oleh hati yaitu: (1) pemberian makanan yang kaya karbohidrat, sehingga meningkatakan kecepatan lipogenesis dan esterifikasi asam lemak; (2) kadar asam lemak bebas yang tinggi dalam darah; (3) adanya insulin dengan konsentrasi tinggi, dan glukagon dengan konsentrasi rendah, yang akan meningkatkan sintesis, esterifikasi asam lemak dan menghambat proses oksidasinya.
Jaringan Adiposa merupakan Simpanan Utama Triasilgliserol Dalam Tubuh
Simpanan triasilgliserol terus-menrus mengalami lipolisis (hidrolisis) dan resterifikasi (gambar 09). Banyak faktor nutrisi, metabolisme dan hormonal yang mengatur metabolisme pada jaringan adiposa bekerja pada proses esterifikasi atau lipolisis. Hasil akhir kedua proses ini menentukan besaran depot asam lemak bebas dalam jaringan adiposa, yang selanjutnya menjadi sumber dan penentu kadar asam lemak bebas yang beredar dalam plasma.
Penyediaan Senyawa Gliserol 3-fosfat Mengatur Esterifikasi: Lipolisis Dikendalikan oleh Lipase yang Peka Hormon
Dalam jaringan adiposa, triasilgliserol disintesis dari asil-KoA dan gliserol 3-fosfat. Karena enzim gliserol kinase memperlihatkan aktivitas yang rendah dalam jaringan adiposa, senyawa gliserol tidak dapat dimanfaatkan sampai taraf lanjut dalam proses esterifikasi asil-KoA. Untuk penyediaan senyawa gliserol 3-fosfat, jaringan tersebut bergantung pada glikolisis dan pasokan glukosa.
Triasilgliserol menjalani hidrolisis oleh enzim lipase yang peka hormon untuk membentuk asam-asam lemak bebas dan gliserol. Karena gliserol tidak dapat segera dimanfaatkan dalam jaringan ini, senyawa tersebut akan berdifusi untuk memasuki plasma dan digunakan oleh jaringan sperti hati dan otot yang memiliki enzim aktif gliserol kinase. Asam lemak bebas yang terbentuk dari lipolisis dapat diubah kembali dalam jaringan menjadi asil-KoA oleh enzim asil-KoA sintetase dan menjalani resterifikasi dengan senyawa gliserol 3-fosfat untuk membentuk triasilgliserol. Jadi, dalam jaringan terdapat siklus lipoprotein dan resterifikasi yang berkesinambungan.
Peningkatan Metabolisme Glukosa Mengurangi Keluaran Asam Lemak Bebas
Kalau penggunaan glukosa oleh jaringan adiposa meningkat, aliran keluar asam lemak bebas akan berkurang, namun pelepasa gliserol akan berlangsung terus. Efek tersebut dianggap terjadi sebagai akibat penyediaan gliserol 3-fosfat, yang meningkatkan esterifikasi asam-asam lemak bebas lewat asil-KoA.
Glukosa dapat melewati beberapa lintasan metabolisme dalam jaringan adiposa, yang mencakup oksidasi menjadi CO2 lewat siklus asam sitrat, oksidasi dalam lintasan pentosa fosfat, konversi menjadi asam-asam lemak rantai panjang, dan pembukaan asilgliserol lewat gliserol 3-fosfat. Namun dengan berkurangnya pemakain total glukosa, sebagian besar glukosa akan diarahkan kepada pembentukan gliserol 3-fosfat untuk esterifikasi asil-KoA, yang membantu mengurangi aliran keluar asam-asam lemak bebas.
Insulin Mengurangi Keluaran Asam Lemak Bebas
Kecepata pelepasan asam lemak bebas dari jaringan adiposa dipengaruhi oleh banyak hormon, dan hormon-hormon ini mempengaruhi laju esterifikasi atau laju lipolisis. Insulin menghambat pelepasan asam lemak bebas dari jaringan adiposa, yang diikuti dengan penurunan kadar asam lemak bebas dalam plasma. Hormon ini menigkatkan lipogenesis, sintesis asilgliserol dan juga menambah oksidasi glukaosa menjadi CO2 lewat lintasn pentosa fosfat.
Funngsi utama dari hormon insulin pada jaringan adiposa adalah menghambat aktivitas enzim lipase yang peka hormon, dengan menurunkan pelepasan, nukan saja asam-asam lemak bebas tetapi juga gliserol. Jaringan adiposa jauh lebih peka terhadap insulin dibandingkan dengan banyak jatingan lainnya, dan hal ini menunjukkan jaringan adiposa sebagai tempat kerja insulin yang penting dalam keadaan in vivo.
Sejumlah Besar Hormon Mampu Menggalakkan Lipolisis
Sejumlah hormon dapat mempercepat pelepasan asam lemak bebas dari jaringan adiposa dan menaikkan kadar asam lemak plasma dengan meningkatkan kecepatan lipolisis pada simpanan triasilgliserol (gambar 10).Hormon-hormon ini meliputi efinefrin, norefinefrin, glukagon, hormon adrenokortikotrofik (ATCH), hormon perangsang α-dan β-melanosit (MSH), hormon pertumbuhan (GH) dan vasopresin. Untuk memperoleh efek yang optimal, sebagian besar proses lipolitik ini memerlukan keberadaan hormon tiroid dan glukokortikoid. Kedua hormon ini tidak meningkatkan lipolisis secara mencolok tetapi bekerja dengan kemampuan fasilitasi dan memudahkan berkenaan dengan faktor-faktor endokrin lipolitik lainnya.
Hormon yang bekerja cepat dalam menggalakkan lipolisis adalah ketekolamina, melaksanakanya dengan merangsang aktivitas adenilat siklase, yaitu enzim yang mengubah ATP menjadi cAMP. Dengan merangsang enzim protein kinase yang bergantung pada cAMP, senyawa cAMP akan mengubah bentuk inaktif enzim triasilgliserol lipase peka hormon menjadi bentuk aktif enzim lipase. Lipolisis sebagian besar dikendalikan oleh jumlah cAMP yang ada dalam jaringan. Senyawa cAMP diuraikan menjadi 5’-AMP oleh enzim fosfodiesterase senyawa 3’,5’-nukleotida siklik.
Insulin bekerja antagonis terhadap efek hormon lipotetik. Efek antilipotetik yang dimiliki insulin dapat ditimbulkan oleh penghambatan sintesis cAMP pada tempat adenilat siklase. Efek hormon pertumbuhan dalam menggalakkan lipolisis bekerja lambat. Efek ini tergantung pada sintesis protein terlibat dalam pembentukan cAMP. Hormon-hormon glukokortikoid mengglakkan lipolisis lewat sintesis protein lipase yang baru melalui lintasan yang tidak bergantung cAMP dapat dihambat oleh insulin.
SINTESIS, PENGANGKUTAN DAN EKSKRESI KOLESTEROL
Kolesterol adalah molekul biologis yang berperan sangat penting dalam sintesis membran sel, prekusor sintesis hormon steroid, hormon korteks adrenal dan sintesis asam- asam empedu dan vitamin D. Kolesterol terdiri atas high density cholesterol (HDL), low density cholesterol (LDL) dan trigliserida. HDL berperan dalam membawa kolesterol dari aliran darah ke hati. LDL berperan dalam membawa kolesterol kembali ke aliran darah. Kolesterol yang terdapat dalam tubuh dapat berasal dari makanan (eksogen) atau disintesis oleh tubuh (endogen).
Kolesterol merupakan jenis lemak yang paling dikenal oleh masyarakat. Kolesterol merupakan komponen utama pada struktur selaput sel dan merupakan komponen utama sel otak dan saraf. Kolesterol merupakan bahan perantara untuk pembentukan sejumlah komponen penting seperti vitamin D (untuk membentuk & mempertahankan tulang yang sehat), hormon seks (contohnya Estrogen & Testosteron) dan asam empedu (untuk fungsi pencernaan ). Kolesterol tubuh berasal dari hasil pembentukan di dalam tubuh (sekitar 500 mg/hari) dan dari makanan yang dimakan. Pembentukan kolesterol di dalam tubuh terutama terjadi di hati (50% total sintesis) dan sisanya di usus, kulit, dan semua jaringan yang mempunyai sel-sel berinti. Jenis-jenis makanan yang banyak mengandung kolesterol antara lain daging (sapi maupun unggas), ikan dan produk susu. Makanan yang berasal dari daging hewan biasanya banyak mengandung kolesterol, tetapi makanan yang berasal dari tumbuh-tumbuhan tidak mengandung kolesterol.
1.Biosintesis Kolesterol
Sintesis kolesterol di mulai dari perpindahan asetil-KoA dari mitokondria ke sitosol, khususnya di peroksisom. Biosintesis kolesterol terjadi di 25 % di organ hati dan 10% di usus (Endo,at all,1976). Terdapat lima tahapan utama dalam biosintesis kolesterol yaitu:
a.Mevalonat, yang merupakan senyawa enam-carbon, disintesis dari asetil KoA
Sintesis kolsterol berlangsung dilur mitokondria. Pada mulanya, dua molekul asetil KoA berkondensasi membentuk asetoasetik KoA dan reaksi kondensasi ini dikatalisis enzim sitosol tiolase. reaksi lain yang berlangsung di dalam hati, yaitu senyawa setoasetat yang dibuat di dalam mitokonsria dalam lintasan ketogenesis berdifusi ke dalam sitosol dan mungkin diaktifkan menjadi asetoasetil KoA oleh enzim asetoasetil KoA sintetase, dengan menggunakan ATP dan KoA. Asetoasetil KoA berkondensasi dengan molekul asetil KoA berikutnya untuk membentuk 3-hidroksi-3-metilglutarin-KoA (HMG-KoA) dan reaksi kondensasi ini dikatalisis oleh enzim HMG-KoA sintetase. HMG-KoA diubah menjadi mevalonat dalam sebuah proses reduksi dua tahap oleh NADPH dengan dikatalisis oleh enzim HMG-KoA reduktase.
b.Unit isoprenoid dinbentuk dari mevalonatmelalui pelepasan CO2
Mevalonat mengalami fosforilasi oleh AT untuk membentuk beberapa senyawa antara terfosforilasi aktif. Dengan bantuan reaksi dekarboksilasi terbentuk iso-pentenilpirofosfat.
c.Enam unit isorenoid mengadakan kondensasi untuk membentuk senyawa antara skualena
Tahap ini meliputi kondensasi tiga molekul isompentenilpirofosfat untuk membentuk farnesil pirofosfat. Proses ini terjadi lewat isomerisasi senyawa isopentenilpirofosfat yang meliputi pergeseran ikatan rangkap untuk membentuk dimetilalil pirofosfat, kemudian diikuti oleh kondensasi dengan molekul isopentil pirofosfat lainnya hingga terbentuk senyawa antara geranil pirofosfat. Kondensasi selanjutnya dengan isopentenilpirofosfat membentuk farsenil pirofosfat. Dua molekul fernesil pirofosfat berkondensasi pada ujung irofosfat dalam sebuah reaksi yang meliputi pertama-tama eliminasi pirofosfat hingga terbentuk praskuelena pirofosfat dan kemudian diukuti oleh reduksi dengan NADPH yang disertai eliminasi radikal pirofosfat sisanya. Senyawa yang dihasilkan adalah skualena. Selanjutnya lintasan trans-metilglukonat mengeluarkan dimetililpirofosfat dan mengembalikannya lewat trans-3metilglutakonat-KoA, menjadi HMG-KoA. Lintasan ini memegang peranan penting dalam keseluruhan laju sintesis kolesterol.
d.Skualena mengalami siklisasi untuk menghasilkan senyawa steroid induk yaitu lanosterol
Skualena memunyai struktur yang sangat mirip dengan inti steroid. Sebelum terjadi penutupan cincin, skualena diubah menjadi skualena 2,3-dioksida oleh enzim oksidase dengan fungsi campuran di dalam reticulum endoplasma, yaitu enzim skualena epoksidase. Gugus metal pada C14 dipindahkan kepada C13, dan pada C8 kepada C14 ketika terjadi siklisasi yang dikatalisis oleh enzim oksidoskualena: lanosterol siklase.
e.Kolesterol dibentuk dari lanosterol setelah melewati beberapa tahapan
Dalam tahap ini terjadi pembentukan kolesterol dari lanosterol yang berlangsung di dalam reticulum endoplasma dan meliputi perubahan pada inti steroid serta rantai samping. Gugus metal pada C14 dioksidasi menjadi CO2 untuk membentuk 14-desmetil lanosterol. Dua gugus metal pada C4 dikeluarkan untuk memproduksi zimosterol. D7,24-kolestadienol dibentuk dari zimosterol melalui pergeseran ikatan rangkap diantara C8 dan C9 ke posisi diantara C8 dan C7. Demosterol dibentuk pada titik ini oleh pergeseran ikatan rangkap dalam cincin B, untuk mengambil posisi diantara C5 dan C6, seperti halnya dalam kolesterol. Kolesterol dihasilkan ketika ikatan rangkap pada rantai samping direduksi.
2.Pengangkuan kolesterol
Kolesterol pada umunya ditemukan dalam bentuk teresterifikasi. Kolesterol diangkut dalam lipoprotein pada plasma. Ester kolesterol dalam makanan akan dihidrolisis menjadi kolesterol bebas, yang kemudian bercampur dengan kolesterol bebas dari makanan dan kolesterol empedu sebelum diserap dari dalam usus bersama dengan unsure lipid lainnya. Senyawa ini bercampur dengan kolesterol yang disintesis dalam usus, kemudian disatukan ke dalam kilomikron. Dari kolesterol yang diserap, 80-90% akan mengalami esterifikasi dengan asam lemak rantai panjang di dalam mukosa usus. Ketika kilomikron bereaksi dengan lipoprotein lipase untuk membentuk sisa kilomikron, hanya sekitar 5% ester kolesteril yang hilang dan sisanya diambil oleh hati ketika sisa kilomikron bereaksi dengan reseptor apoE atau reseptor LDL dan dihidrolisis menjadi kolesterol bebas, VLDL yang terbentuk dalam hati mengangkut kolesterol ke dalam plasma. Sebagian besar kolesterol dalam VLDL tertahan di dalam sisa VLDL (IDL) yang diambil oleh hati atau diubah menjadi LDL yang selanjutnya akan diambil oleh reseptor LDL dalam hati dan jaringan ekstrahepatic.
Akitivitas LCAT berkaitan dengan jenis HDL yang mengandung apoA-I. Dengan teresterifikasinya kolesterol dalam HDL, perbedaan gradient (konsentrasi) akan terjadi dan menarik kolesterol dari jaringan serta lipoprotein lainnya. Protein pemindah ester kolesteril akan memperlancar proses pemindahan ester kolesteril dari HDL ke VLDL, LDL dan dalam jumlah kecil kepada kilomikron. Protein ini memungkinkan pemindahan triasil gliserol ke arah yang berlawanan. Karena itu, protein tersebut menghilangkan inhibisi produk hasil aktivitas LCAT dalam HDL. Secara bersamaan, HDL2 yang kaya triasil gliserol, melepaskan muatan di dalam hati setelah bereaksi dengan enzim lipase hepatic kemudian didaur ulang sebagai HDL3.
3.Ekskresi kolesterol
Kolesterol yang diekskresikan ke dalam empedu akan diserap kembali. Ekskresi garam empedu akan diserap kembali ke dalam sirkulasi porta, diambil oleh hati dan diekskresikan kembali ke dalam empedu. Garam empedu yang tidak diserap diekskresikan ke dalam feses.
Asam empedu primer disintesis dalam hati oleh kolesterol. Asam empedu ini adalah asam kolat (yang ditemukan dalam jumlah besar) serta asam kenodeoksikolat, dan keduanya dibentuk dari prazat yang sama di mana prazat ini sendiri berasal dari kolesterol.
Reaksi 7a-hidroksilasi pada kolesterol merupakan tahap pertama yang harus ada dalam biosintesis asam empedu, dan reaksi ini membatasi kecepatan dalam lintasan untuk sintesis asam empedu tersebut. Reaksi tersebut dikatalisis oleh enzim 7a-hidroksilase, yaitu suatu enzim mikrosomal. Reaksi 7a-hidroksilasi ini memerlukan oksigen NADPH serta sitokrom P450, dan tampaknya merupakan reaksi monooksigenase yang khas. Tahap hidroksilase berikutnya juga dikatalisis oleh enzim monooksigenase. Defisiensi vitamin C akan menggangu pembentukan asam empedu pada tahap 7a-hidroksilasi, dan menyebabkan penumpukan kolesterol serta aterosklerosis pada hewan marmut yang menderita penyakit skorburt.
Awal lintasan pada biosintesis asam empedu akan terbagi menjadi satu sublintasan yang meghasilkan kolil KoA yang ditandai oleh gugus ekstra a-OH pada posisi 12, dan lintasan lain yang menghasilkan kenodeoksikolil KoA. Di luar perbedaan ini, kedua lintasan meliputi reaksi hidroksilasi dan pemendekan rantai samping yang serupa, untuk menghasilkan struktur asam empedu yang khas dengan gugus a-OH pada posisi 3 serta 7 dan saturasi penuh pada inti steroid. Asam empedu primer ini memasuk empedu sebagai konyugat glisin atau taurin. Pada manusia rasio konyugat glisin terhadap taurin normalnya 3:1. Mengingat getah empedu mengandung kalium serta natrium dengan jumlah yang bermakna dan pHnya alkalis, maka diasumsikan bahwa asam empedu dan konyugatnya sebenarnya berbentuk garam karena itu geah empedu dunamakan garam empedu.
Sebagian dari asam empedu primer yang ada dalam usus mengalami beberapa perubahan selanjutnya oleh aktivitas bakteri intestinal. Perubahan ini mencakup reaksi dekonyugasi dan 7a-hidroksilasi, yang menghasilkan asam empedu sekunder, yaitu asam deoksikolat dari asam kolat, dan asam litokolat dari asam kenodeoksikolat.
Meskipun hasil pencernaan lemak, termasuk kolesterol, diserap dalam bagian 100 cm pertama usus halus, namun asam empedu rimer dan sekunder hampir tanpa terkecuali diserap di dalam ileum, dengan pengaliran sekitar 98-99% asam empedu yang diekskresikan ke dalam usus kembali ke hati lewat sirkulasi porta. Peristiwa ini dikenal sebagai sirkulasi enterohepatik. Akan tetapi, asam litokolat tidak diserap kembali dalam jumlah yang berarti karena sifat tak larut yang dimilikinya.
Sebagian kecil garam empedu (mungkin hanya 400mg/hari) tidak ikut diserap dan dengan demikian dikeluarkan dari tubuh bersama feses. Meskipun jumlah ini sangat sedikit, namun lintasan tersebut merupakan lintasan utama untuk mengeluarkan kolesterol. Sirkulasi enterohepatik garam empedu terjadi begitu efisien sehingga tiap harinya depot asam empedu yang relative kecil (sekitar 3-5 gram) yang didaur melalui intestinum sebanyak 6-10 kali dengan jumlah kehilangan yang kecil dalam feses, yaitu kurang lebih sebanyak 1-2% per kali lintasan lewat sirkulasi enterohepatik. Namun demikian, setiap harinya, asam empedu dengan jumlah sama seperti jumlah yang hilang dalam feses akan disintesis dari kolesterol dalam hati, sehingga depot asam empedu dapat dipertahankan dengan ukuran yang tetap. Hal ini dicapai lewat system pengendalian umpanbalik. Tahap utama yang membatasi kecepatan reaksi biosintesis asam empedu terletak pada reaksi 7a-hidroksilasi, dan tahap tersebut dalam biosintesis kolesterol berada pada tahap HMG-KoA reduktase. Aktivitas kedua enzim ini sering mengalami perubahan yang sejajar, sehingga sulit dipastikan apakah penghambatan sintesis asam empedu pertama-tama terjadi pada tahap HMG-KoA reduktase atau pada reaksi 7a-hidroksilase. Kedua enzim memperlihatkan variasi diurnal serupa pada aktivitasnya. Induksi gen bagi 7a-hidroksilase oleh kolesterol dalam makanan dan supresinya oleh asam empedu pernah diperagakan. Dalam hal ini, kembalinya garam empedu ke hepar lewat sirkulasi enterohepatik merupakan pengendalian yang penting karena jika terganggu, proses ini akan mengaktifkan enzim 7a-hidroksilase. Enzim (di samping HMG-KoA reduktase) dapat dikendalikan oleh reaksi fosforilasi-defosforilasi yang kovalen. Berbeda dengan HMG-KoA reduktase, bentuk terfosforilasi itulah yang meningkatkan aktivitas kerja enzim 7a-hidroksilase.
